Modificación del ADN

Katya Nicole Sanchez Sampedro

Israel Mena Mena

Omar Robles Ruiz

Introducción 

La modificación del ADN representa uno de los avances más importantes de la biotecnología contemporánea al permitir intervenir de manera dirigida sobre el material genético. Asimismo se comprende como un proceso en el que los conocimientos químicos y moleculares permiten intervenir sobre una de las moléculas fundamentales para la vida esto ha hecho posible identificar, cortar y modificar secuencias específicas de ADN abriendo nuevas posibilidades para comprender y tratar diversas enfermedades, estas tecnologías pueden aplicarse tanto en células somáticas como en células germinales, sin embargo mientras las modificaciones realizadas en células somáticas no se transmiten a la descendencia, aquellas efectuadas en células germinales o embriones pueden incorporarse al material genético de las generaciones futuras. En el ámbito de la salud humana la edición genética ha despertado gran interés debido a su potencial para desarrollar nuevas estrategias terapéuticas y contribuir al tratamiento de enfermedades, su aplicación ha sido estudiada en diferentes áreas de la medicina, incluyendo enfermedades hematológicas, oncológicas, infecciosas, neurológicas, hepáticas, oftalmológicas y pulmonares, estas herramientas permiten generar modelos celulares y animales que facilitan la investigación biomédica y el estudio de los mecanismos relacionados con distintas enfermedades. Asimismo esto plantea interrogantes que trascienden el ámbito científico, uno de los principales puntos de debate corresponde a la edición genética de células germinales y embriones debido a que sus efectos podrían transmitirse a personas que aún no han nacido y que no pueden participar en la decisión sobre dicha modificación, a esto se suman riesgos relacionados con modificaciones genéticas no deseadas, efectos impredecibles y consecuencias que podrían manifestarse a largo plazo o en generaciones posteriores, por esta razón la modificación del ADN humano ha generado un amplio debate científico, ético y social ya que ofrece oportunidades para la medicina y la investigación, pero también obliga a considerar sus posibles consecuencias para las personas y las generaciones futuras. Por ello, analizar la modificación del ADN desde una perspectiva científica y humana resulta fundamental para comprender tanto sus posibles beneficios terapéuticos como los riesgos y dilemas que acompañan su desarrollo y aplicación.

DESARROLLO

Las recombinaciones específicas del sitio se han empleado ampliamente para una manipulación genética eficiente 47, lo que permite la inserción, escisión e intercambio de genes diana a través de diversos contextos celulares y tisulares 17,48. Las tecnologías clave incluyen el intercambio de casetes mediados por recombinasa (RMCE), la integración asistida por serina y la recombinasa de tirosina de genes para la investigación de alto rendimiento (STRAIGHT-IN), la reorganización y modificación de cromosomas sintéticos por la evolución mediada por LoxPsym (SCRaMbLE), el ensamblaje recombinante de la serina integrasa (SIRA), el intercambio de casetes de integrasa dual (DICE), la ingeniería del genoma asistido por la serina con recombinasa (SAGE) y las tecnologías de focalización por sitios gemelos mediada por recombinasa (RMTT) basadas en recombinasas de tirosina  o serina. Sin embargo, la dependencia de la "secuencia de la plataforma de aterrizaje" del sitio de reconocimiento del ADN para la función de la recombinasa en el entorno celular de los mamíferos limita su amplia aplicación en la investigación biomédica y terapéutica 43. Los enfoques tradicionales basados en la recombinación, como el sistema Cre-lox, exhiben especificidad del sitio, pero carecen de programabilidad y guía la dependencia del ARN. A pesar de su amplia aplicación, incluso en estudios in vivo, sigue habiendo una necesidad crítica de desarrollar tecnologías de próxima generación que sean programables y guiadas por ARN, lo que permita así una ingeniería del genoma más precisa y flexible.

Las meganucleasas, también conocidas como endonucleasas homing, son una de las primeras clases de nucleasas programables utilizadas en la edición del genoma. Estas endonucleasas naturales generalmente reconocen grandes secuencias de ADN objetivo (14-40 pares de base [bp]). Reconocen los sitios de escisión del ADN e inducen DSB específicos del sitio. Las meganucleasas exhiben una especificidad inherentemente alta que minimiza la actividad fuera del objetivo; su tamaño relativamente pequeño facilita la administración y permite una recombinación homóloga eficiente, lo que las hace ventajosas para las aplicaciones terapéuticas. Estas ventajas van acompañadas de una menor citotoxicidad potencial. Sin embargo, las meganucleasas fueron históricamente limitadas debido a la dificultad de reprogramar la especificidad del objetivo.

Una ZFN es una proteína quimérica compuesta por un dominio de unión al ADN del dedo de zinc y un dominio de endonucleasa de restricción FokI. La primera proteína de dedo de zinc, el factor de transcripción IIIA (TFIIIA), una proteína reguladora rica en cisteína, se identificó en 1985 en los ovocitos de Xenopus. Las proteínas pertenecientes a la superfamilia TFIIIA poseen dominios de dedo de zinc Cys2His2, que facilitan la unión de ácido nucleico. El dominio del dedo de zinc Cys2His2_, que consiste en aproximadamente 30 aminoácidos, exhibe un motivo estructural conservado de dos cadenas β antiparalelas seguidas de una hélice α.^{34,35,36,37,38,39} Este dominio se encuentra entre las estructuras de unión al ADN más prevalentes que se encuentran en los factores de transcripción eucariotas. Cada motivo de dedo de zinc reconoce una secuencia de ADN de tres pb a través de interacciones específicas entre la hélice α del dominio y el surco principal del ADN.¹⁸ Este mecanismo de reconocimiento permite el enlace selectivo a trillizos de nucleótidos, lo que permite la personalización de la especificidad del objetivo.17,35,40,41,42 El dominio del dedo de zinc dirige la unión de ADN específica de la secuencia, mientras que el dominio FokI media la escisión del ADN para generar DSB en loci predefinidos, facilitando la recombinación del ADN.

CRISPR-Cas9

El sistema CRISPR-Cas es actualmente la plataforma de edición del genoma más utilizada en los laboratorios de biología molecular, debido a su diseño sencillo, bajo costo, alta eficiencia, reproducibilidad y ciclo experimental corto. En 2012, se dilucida con precisión la función del sistema CRISPR-Cas, y se demostró su potencial como herramienta de edición del genoma.^26,49 Este sistema proporciona protección contra los bacteriófagos y el ADN exógeno a través de la integración de espaciadores derivados de invasores en la matriz CRISPR y la posterior escisión del material genético invasor.^50,51 Los sistemas CRISPR se clasifican ampliamente en dos clases: los sistemas de clase I, que se caracterizan por complejos efectores multiproteicos (tipos I, III y IV), y los sistemas de clase II, que se basan en efectores de una sola proteína (tipos II, V y VI).^52,53 Entre ellos, CRISPR-Cas9 (clase II, tipo II) es una de las herramientas de edición de genoma más investigadas y ampliamente aplicadas.^52,58 Además del subtipo tipo II-A Streptococcus pyogenes Cas9 (SpCas9) ampliamente utilizado, otros ortólogos Cas9 como SaCas9  (tipo II-A), FnCas9 (tipo II-B), NmeCas9 (tipo II-C) y CjCas9 (tipo II-C) se están utilizando cada vez más por sus propiedades únicas, incluyendo un tamaño más pequeño y la compatibilidad con el motivo alternativo adyacente al protoespaciador (PAM) .^{26,59,60,61,62} Además, varios sistemas CRISPR que no Cas9, como Cas12, Cas13 y Cas14, así como las tecnologías de edición de próxima generación, los editores base y los editores versatilidad y precisión mejoradas. CRISPR-Cas9 sigue siendo la herramienta de edición del genoma tecnológicamente más avanzada y ampliamente implementada, lo que justifica una discusión más profunda de sus mecanismos y aplicaciones en la siguiente sección.El sistema CRISPR-Cas9 comprende dos componentes esenciales: un ARN guía (ARNg) y la proteína 9 asociada a CRISPR (Cas9). Conocido como "tijeras genéticas", CRISPR-Cas9 escinde el ADN de doble cadena en los sitios objetivo a través de su actividad de endonuclesa.⁶³ El gRNA consta de dos subunidades: el crRNA y el tracrRNA. El ARN CRISPR (crRNA), de aproximadamente 18-20 nucleótidos de longitud, se hibrida con la secuencia de ADN objetivo, mientras que el crRNA transactivador (ARNtracrRNA) sirve como un andamio para la unión de Cas9. El tracrRNA interactúa de forma complementaria con regiones específicas del ARNcr, facilitando así el ensamblaje y la activación adecuados del complejo gRNA-Cas9. Tanto el crRNA como el tracrRNA son necesarios para activar funcionalmente el sistema CRISPR-Cas9. La proteína Cas9 consta de dos lóbulos estructurales principales: el lóbulo de reconocimiento (REC) y el lóbulo de la nucleasa (NUC).^26,27,80 El lóbulo REC incluye los dominios REC1 y REC2, que median la unión a gRNA. El lóbulo NUC contiene tres dominios funcionales: RuvC y HNH, que esciden las hebras opuestas del ADN, y el dominio que interactúa con PAM, que identifica el PAM necesario para el reconocimiento del ADN objetivo.^26,27,80

El mecanismo de edición del genoma mediado por CRISPR-Cas9 sigue tres pasos principales: (1) reconocimiento de la secuencia objetivo, (2) inducción de la escisión de ADN de doble cadena y (3) reparación de ADN.¹⁹ En el paso inicial, un ARN de guía única (sgRNA) diseñado dirige Cas9 al objetivo de ADN específico emparejando la base con el objetivo a través de su secuencia espaciadora. Al mismo tiempo, Cas9 se involucra con una secuencia de PAM ubicada inmediatamente aguas abajo del sitio objetivo. El PAM es un motivo de ADN corto y conservado, generalmente de 2 a 5 nucleótidos de longitud, con variación de secuencia dependiendo de la especie bacteriana de origen.^58,81,82 SpCas9 generalmente reconoce secuencias PAM con el consenso 5'-NGG-3', donde N representa cualquier nucleótido.^58,81,82 Tras el reconocimiento de PAM, se forma un híbrido de ARN-ADN, y Cas9 induce un DSB dividiendo la cadena de ADN complementaria a través del dominio HNH y la cadena no complementaria a través del dominio RuvC.19,63,83 El DSB resultante se repara posteriormente por las vías de reparación de ADN endógena de la célula.

Una limitación significativa de la plataforma CRISPR-Cas9 es la aparición de efectos fuera del objetivo, que ocurren cuando el complejo CRISPR-Cas9 se une y escinde sitios genómicos no deseados.⁸⁴ Tal actividad fuera del objetivo puede interrumpir los genes críticos para la función celular normal o la regulación de la proliferación, lo que potencialmente resulta en mutaciones perjudiciales y el desarrollo de enfermedades.85 Para abordar este problema, el desarrollo de herramientas avanzadas de edición del genoma con mayor especificidad es esencial para mejorar la precisión y la seguridad de las terapias basadas en CRISPR. Hay varios métodos de perfilado en todo el genoma para detectar la actividad fuera del objetivo, por ejemplo, (1) identificación de DSB inducidas por Cas9: GUIDE-seq y CIRCLE-seq, (2) mapeo en todo el genoma de los sitios de escisión Cas9: Digenome-seq y SITE-seq, y (3) estimación de posibles sitios fuera del objetivo: herramientas de predicción in silico.^{86,87,88,89,90,91} Otra limitación de la plataforma CRISPR-Cas9 es el reconocimiento de secuencias PAM, que restringe las ubicaciones genómicas a las que CRISPR puede apuntar. Los científicos están desarrollando variantes de Cas9 con especificidades alteradas de PAM. Por ejemplo, SpCas9-NG puede reconocer NG en lugar de NGG, y xCas9 puede reconocer una secuencia PAM variante.⁹² Estas variantes expanden sitios objetivo y mitigan las restricciones PAM.

Más allá del CRISPR-Cas9 convencional y otros enfoques de edición del genoma dependientes de DSB, ha surgido una gama de nuevas tecnologías. Estas plataformas se derivan de los sistemas CRISPR y están diseñadas para editar ADN, ARN o expresión génica con características variables. Se clasifican en función de su especificidad, eficiencia y aplicación práctica.

 Implicaciones para la profesión

El conocimiento de las técnicas relacionadas con el análisis y la modificación del ADN tiene una importancia directa para la formación y el ejercicio profesional del Químico Farmacéutico Biólogo (QFB), debido a su participación en áreas como el diagnóstico clínico, la investigación, el laboratorio y las ciencias farmacéuticas. El perfil profesional de la UACJ señala que el QFB debe desarrollar competencias para el diagnóstico clínico, trabajar bajo sistemas de calidad, interpretar y controlar resultados, realizar investigación y desenvolverse de manera ética e interdisciplinaria.

Una de las principales implicaciones se encuentra en el diagnóstico molecular. Las técnicas de análisis del ADN permiten detectar mutaciones asociadas con enfermedades y que, para las mutaciones puntuales, pueden emplearse métodos de cribado como SSCP antes de recurrir a la secuenciación para caracterizar la alteración. La técnica SSCP destaca por ser relativamente sencilla y económica, además de poder utilizarse en estudios rutinarios; sin embargo, requiere la optimización de variables como la composición del gel y otros parámetros que pueden modificar su sensibilidad. Por ello, para nosotros como QFB no basta con conocer el procedimiento experimental: también es necesario comprender sus alcances, limitaciones, controles y condiciones de trabajo, así como reconocer cuándo un resultado requiere una técnica de confirmación.

Esto también incrementa la responsabilidad del profesional sobre la calidad y confiabilidad de los resultados. Un resultado molecular puede contribuir a la confirmación diagnóstica, al diagnóstico presintomático, al estudio de portadores y a los diagnósticos prenatal y preimplantacional. Asimismo, nosotros como QFB debemos desarrollar capacidades para analizar e interpretar correctamente los resultados y evitar que una variación genética sea considerada automáticamente como una enfermedad, ya que los documentos señalan que algunos cambios en el ADN pueden no producir efectos fenotípicos, mientras que otros sí pueden alterar la función de una proteína.

Otra implicación importante es la necesidad de una formación científica y tecnológica continua. El desarrollo de herramientas de edición genética ha ampliado las posibilidades de investigación biomédica y de desarrollo de terapias, así como sus aplicaciones en otras áreas de las ciencias de la vida. Esto hace necesario que el profesional mantenga actualizados sus conocimientos sobre biología molecular, análisis genético, técnicas de laboratorio y nuevas tecnologías, especialmente porque la elección de una metodología depende del tipo de alteración genética y de las características del gen estudiado.

Sin embargo, el desarrollo de estas tecnologías también amplía la responsabilidad ética y social como profesionales de la salud. Los documentos identifican las implicaciones éticas, legales y sociales de la edición genética como uno de los principales ejes del debate, junto con su regulación y gobernanza. En particular, se plantea la necesidad de evaluar los riesgos, realizar un seguimiento a largo plazo, proteger la privacidad de los pacientes y establecer mecanismos para prevenir usos no terapéuticos. Además, las investigaciones relacionadas con estas tecnologías requieren procesos de evaluación por comités especializados y consentimiento informado.

La confidencialidad de la información genética adquiere especial relevancia. La UNESCO considera que los datos genéticos humanos son datos sensibles debido a que pueden revelar predisposiciones, tener consecuencias para familiares y conservar importancia incluso durante generaciones. Por ello, establece la necesidad de proteger su privacidad y confidencialidad, así como de garantizar la exactitud, fiabilidad, calidad y seguridad de estos datos. Esto implica que el profesional que participe en la obtención, procesamiento o interpretación de información genética debe manejar con responsabilidad y respetar los principios relacionados con el consentimiento y la protección de los datos.

En conjunto, las técnicas de análisis y modificación del ADN implican combinar conocimientos de biología molecular y técnicas de laboratorio con capacidad de interpretación, control de calidad, actualización científica y responsabilidad ética. Su función no se limita a ejecutar una técnica, sino que comprende valorar la confiabilidad de los resultados, reconocer las limitaciones de cada método, proteger la información genética y participar responsablemente en la aplicación de los avances de la genética en beneficio de la salud y la sociedad.

 CONCLUSIÓN

Los esfuerzos de investigación en curso continúan centrándose en mejorar la eficiencia y versatilidad de los sistemas CRISPR, así como en mejorar las plataformas de entrega de genes. En particular, se está haciendo un progreso sustancial en la optimización de los enfoques de entrega in vivo para maximizar la eficiencia de la edición y minimizar los efectos fuera del objetivo. Estos avances han ampliado significativamente el potencial terapéutico de CRISPR, apoyando el desarrollo de estrategias ex vivo e in vivo para el tratamiento de trastornos genéticos, tumores malignos y otras afecciones complejas. El éxito futuro de las terapias basadas en CRISPR dependerá de nuevas mejoras en la precisión de edición y las tecnologías de entrega. Los desafíos técnicos persistentes, como mejorar la eficiencia de la administración, minimizar las respuestas inmunitarias y reducir las modificaciones genéticas no deseadas, deben abordarse a través de una investigación continua.

Referencias

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